前言
結(jié)核病(tuberculosis，TB)是一種嚴(yán)重危害人類健康的慢性傳染病，目前全球有約20億人被感染，每年新出現(xiàn)結(jié)核病患者約800萬～1000萬，每年因結(jié)核病死亡人數(shù)約為200萬～300萬。TB是由結(jié)核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis,MTB)引起的呼吸道傳染性疾病，可累及全身多器官系統(tǒng)，最常見的患病部位是肺臟，占各器官TB總數(shù)的80%~90%，也可以累及肝、腎、腦、淋巴結(jié)等器官。MTB主要通過呼吸道傳播。活動(dòng)期肺結(jié)核患者的痰液干燥后，細(xì)菌隨塵土飛揚(yáng)，被他人吸入也可引起感染，人體吸入含有MTB的飛沫是否患病主要由吸入結(jié)核菌的數(shù)量、毒力、人體的抵抗力等多種因素有關(guān)。
TB動(dòng)物模型的制備和應(yīng)用可以獲得TB發(fā)生和發(fā)展中的一些特性，如TB感染后引起的免疫應(yīng)答以及對(duì)病原的相關(guān)研究。此外，標(biāo)準(zhǔn)化的動(dòng)物模型還可應(yīng)用于新研制疫苗的評(píng)價(jià)以及觀察新藥物對(duì)TB的治療效果。根據(jù)動(dòng)物模型來源和應(yīng)用范圍，MTB動(dòng)物模型可分為潛伏感染動(dòng)物模型和急性感染動(dòng)物模型兩大類。
部分造模方法
使用動(dòng)物：小鼠、大鼠、豚鼠
【造模機(jī)制】：
MTB感染可引起活動(dòng)性TB及潛伏感染等。選擇不同品系的動(dòng)物、結(jié)核菌量的多少以及不同感染途徑都可引起模型的差異。使用高劑量的強(qiáng)毒株對(duì)敏感動(dòng)物進(jìn)行攻毒，一般可建立結(jié)核病的急性感染模型。小鼠因其對(duì)MTB高度敏感：遺傳背景清晰、檢測(cè)試劑容易獲得、成本相對(duì)較低且具備比較成熟的基因定向敲除技術(shù)等特點(diǎn)，成為最常用的MTB感染的動(dòng)物模型。不同品系動(dòng)物遺傳特性的差異，小鼠對(duì)MTB的敏感性也不相同，NIH小鼠和BALB/c小鼠對(duì)MTB不敏感；615和TA1小鼠的性別差異大；ICR、TA2和DBA/2小鼠雖然對(duì)MTB較敏感，但每克臟器含菌最顯著低于C57BL/6和昆明鼠。C57BL/6小鼠對(duì)MTB感染最敏感，較為常用。
【造模方法】：
小鼠：不同品系小鼠由于其遺傳特性的不同，其對(duì)結(jié)核分枝桿菌H37Rv株敏感性也不同。如BALB/c和C57BL/6小鼠對(duì)H37Rv敏感性是DBA/2和C3H/HeJ小鼠的2倍，目前常用BALB/c和C57BL/6小鼠復(fù)制MTB感染模型。小鼠尾靜脈接種1×106CFU H37Rv標(biāo)準(zhǔn)毒株，2周后即可出現(xiàn)體重下降，狀態(tài)萎靡，剖檢發(fā)現(xiàn)肺部有明顯的肉芽腫形成（圖6-1A/文末彩圖6-1A)，H&E染色后發(fā)現(xiàn)肉芽腫組織由大量上皮細(xì)胞和淋巴細(xì)胞組成，部分肺組織壞死，紅細(xì)胞滲出明顯，大量淋巴細(xì)胞和泡沫細(xì)胞聚集在支氣管及血管周圍（圖6-1B/文末彩圖6-1B)。小鼠脾、肺臟器研磨進(jìn)行CFU計(jì)數(shù)能獲得較高的荷菌數(shù)。為了更好地模擬MTB的感染途徑，也有采用氣霧發(fā)生器通過呼吸道感染。霧化感染實(shí)驗(yàn)的最適條件為5ml霧化液（細(xì)菌＋生理鹽水）霧化90分鐘，霧化吸入MTB數(shù)以106CFU為最佳，小鼠可出現(xiàn)明顯的結(jié)核肉芽腫病變，部分呈現(xiàn)壞死性改變。
大鼠：大鼠因具有價(jià)格低廉、抵抗力強(qiáng)、血標(biāo)本容易采集等優(yōu)點(diǎn)，比小鼠更適宜實(shí)驗(yàn)中多次采血。常用的大鼠品系有Sprague Dawley大鼠、Wistar大鼠等。以H37Rv毒株為例，大鼠肺臟感染以尾靜脈接種107CFU為宜，肝臟感染以尾靜脈接種108CFU為宜；脾臟感染以尾靜脈接種107CFU為宜，如采用腹腔接種則需活菌數(shù)達(dá)到108CFU。與小鼠類似，大鼠模型同樣不能模擬人的肺部病理改變，不出現(xiàn)常見于人的干酪樣壞死、纖維化、鈣化以及空洞。
豚鼠：豚鼠被廣泛應(yīng)用于MTB感染研究，結(jié)核病理改變與人體相似，尤以結(jié)核肉芽腫結(jié)構(gòu)典型，細(xì)菌含量較低，可發(fā)展為壞死，是目前國際公認(rèn)的TB模型最適動(dòng)物。豚鼠感染途徑多采用腹腔注射、腹股溝或大腿內(nèi)側(cè)皮下注射、前肢皮下靜脈注射等途徑，但以氣溶膠吸入感染方式最能模擬MTB自然感染過程。豚鼠腹股溝或大腿內(nèi)側(cè)皮下注射使用H37Rv菌量為0.3ml（含濕菌重0.3mg)。與其他MTB敏感動(dòng)物相比，豚鼠未建立近交系，并缺乏進(jìn)行免疫學(xué)分析的試劑，使其應(yīng)用受到較大限制。低劑量不同的MTB毒株氣溶膠感染豚鼠，發(fā)現(xiàn)Erdman K01、CSU93/CDC1551和HN878系MTB毒株和實(shí)驗(yàn)室常用H37Rv毒株相比，豚鼠的存活時(shí)間更短。感染30天后，MTB逐漸從肺部彌散到支氣管周淋巴結(jié)、胰周淋巴結(jié)、脾、肝、胰、腎上腺和心臟。
非人靈長類：模擬人TB的最理想模型就是非人靈長類動(dòng)物模型。這類模型對(duì)MTB通過自然途徑感染相當(dāng)敏感，可發(fā)展為與人相似的疾病，包括臨床表現(xiàn)、組織病理變化等方面。同時(shí)，此類模型能夠誘發(fā)抗原特異性T細(xì)胞反應(yīng)，可被卡介苗(BCG)疫苗保護(hù)。最常用的非人靈長類動(dòng)物模型是短尾猴和獼猴。短尾猴用BCG免疫后幾乎可以完全抵抗MTB感染引起的病理損傷，與未免疫動(dòng)物相比大大減少肺組織中的荷菌盤。相反，獼猴用BCG免疫后，可發(fā)生嚴(yán)重的肺組織病理損傷，形成空洞、干酪樣壞死，與未免疫動(dòng)物相比肺中的病灶幾乎不減。與人相似，只有少數(shù)動(dòng)物會(huì)發(fā)病，大多數(shù)進(jìn)入潛伏感染狀態(tài)。如用高菌量(1× 104~1×105 CFU) 的H37Rv經(jīng)氣管內(nèi)感染食蟹猴，可制備急性高致死率的多肺葉TB模型。用中等菌量(1×103CFU)接種動(dòng)物可制備成有臨床癥狀、慢性活動(dòng)、肉眼可見肺病灶、腦膜炎癥狀的TB模型。與小鼠和豚鼠感染模型相比，非人靈長類的感染模型更適合目前的研究。
【造模特點(diǎn)】：
急性感染發(fā)病快、病程短、病情重，具有較高的死亡率。MTB急性感染模型通常是采用大劑量MTB攻擊造成動(dòng)物機(jī)體組織的滲出壞死或增生。根據(jù)機(jī)體的免疫反應(yīng)和變態(tài)反應(yīng)性、菌量、毒力及組織特性的不同，出現(xiàn)不同的干酪樣壞死及滲出為主的病理變化。這些病理變化發(fā)生和發(fā)展較快，如未采用轉(zhuǎn)歸措施，將直接導(dǎo)致動(dòng)物的死亡。
【模型評(píng)估和應(yīng)用】：
國內(nèi)對(duì)MTB感染動(dòng)物造模成功的評(píng)判指標(biāo)尚無統(tǒng)一之標(biāo)準(zhǔn)。多數(shù)以靶器官組織勻漿培養(yǎng)為主要認(rèn)定方法，輔之以組織病理觀察和臟器重量指數(shù)測(cè)定，間或使用結(jié)核菌素試驗(yàn)及組織標(biāo)本抗酸染色等方法。
1.靶器官組織勻漿培養(yǎng) 頸椎脫臼法處死動(dòng)物，無菌分離脾臟、肺臟等靶器官。將組織利用200目濾網(wǎng)研磨過濾。取l00µl懸液稀釋至所需濃度梯度，分別從各梯度中取100µl接種到培養(yǎng)基，置37°C培養(yǎng)箱，3～4周后計(jì)菌落數(shù)。
2.病理組織觀察 病理切片如觀察到較多的結(jié)核結(jié)節(jié)或干酪樣壞死及液化灶等典型結(jié)核病變可作為造模成功的直接認(rèn)定方法。但大多數(shù)嚙齒類動(dòng)物均缺乏典型病理改變，故常須結(jié)合細(xì)菌學(xué)抗酸染色加以確定。因此，組織病理陽性加上抗酸染色陽性成為最客觀、最直接的成功模型確定方法。
3.臟器重量指數(shù)測(cè)定 動(dòng)物主要臟器重量及臟器指數(shù)是藥物慢性實(shí)驗(yàn)檢測(cè)的項(xiàng)目，根據(jù)臟器重量計(jì)算臟器指數(shù)可以判斷內(nèi)臟器官病變的性質(zhì)和程度。當(dāng)某臟器受結(jié)核分枝桿菌H37Rv感染后，該臟器便會(huì)增大增重，用臟器的重量與動(dòng)物體重的值表示感染臟器的病變程度，即臟器重量指數(shù)，該指數(shù)愈大，則表示病變程度愈重。計(jì)算方法：臟器重量指數(shù)＝臟器重量（g)/體重(g)×100%。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物臟器重量臟器指數(shù)是動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中常用的重要基礎(chǔ)數(shù)據(jù)，也是MTB感染模型判別的最常用指標(biāo)。
參考文獻(xiàn)：
1.師長宏，徐志凱，范雄林．結(jié)核分枝桿菌感染的動(dòng)物模型．國外醫(yī)學(xué)（微生物學(xué)分冊(cè)），2004,27 (4):31-34
2.江山，朱道銀．結(jié)核分枝桿菌潛伏性感染發(fā)生機(jī)制的研究進(jìn)展. 國外醫(yī)學(xué)（微生物學(xué)分冊(cè)），2003, 26 (1):31-33
3.侯江厚，李琦，陸宇，等．免疫制劑輔助治療耐多藥結(jié)核分枝桿菌感染動(dòng)物模型的初步研究．中華結(jié)核和呼吸雜志，2012, 35 (12):911-914
4.Ahmad Z, Fraig MM, Pinn M L, el al. Effectiveness of tuberculosis chemotherapy correlales with resistance lo Mycobacterium tuberculosis infection in animal models. J Antimicrob Chemother,2011,66(7): 1560-1566
5.Converse PJ, Karakousis PC, K血kenberg LG,et al. Role of Lhe dosR-dosS two-componenl regulatory system in Mycobaclerium Luberculosis virulence in Lhree animal models. Infect Immun, 2009,77 (3):1230-] 237
6.Hu Y, Henderson B, Lund P A, et al. A Mycobacterium tuberculosis mulant lacking the groEL homologue cpn60. I is viable bul fails to induce an inflammatory response in animal models of infection. Infect lmmun, 2008, 76 (4):1535-154
7.Rivas-Santiago B, Castaneda-Delgado JE，Rivas Santiago CE,el al. Ability of innate defence regulator peptides IDR-1002, IDR-HH2 and lDR-1018 Lo prolect againsl Mycobaclerium tuberculosis infections in animal models. PLoS One,2013,8 (3):e59 119
號(hào)二維碼.jpg)
